Контуры невидимки
Контуры невидимки
Точный физический метод — рентгеноструктурный анализ — помогает расшифровать структуру сложнейших биологических объектов — белковых молекул.
Где-то в середине XVII в. в мире произошло событие, точнее, целая цепочка событий исключительной важности. Они, к сожалению, не вошли в школьные учебники, хотя, нужно думать, повлияли на судьбы цивилизации не меньше, чем восьмой крестовый поход или война Белой и Алой розы. Главный участник этих событий — Антони ван Левенгук из Амстердама, торговец и муниципальный служащий (основная профессия), оптик и натуралист (хобби). С помощью очень сильных самодельных линз — некоторые из них давали увеличение в 300 раз — он увидел живые клетки, бактерии, волокна стебля пшеницы, элементы крови. Одним словом, увидел невидимое.
В эти слова — «увидел невидимое» — нужно вдуматься. Они из той же хартии человеческого могущества, что и «поднялся в воздух», «ввел книгопечатание», «изобрел радио», «расщепил атом», «вышел в космос». Именно это «увидел невидимое» прорубило человеку окно в скрытый от него «по условию» огромный и удивительный микромир. Именно с этого «увидел невидимое» начались многие великие достижения современной физики, химии, биологии, медицины.
Невооруженным глазом можно видеть предметы размером до 0,1 мм. Микроскоп позволяет рассмотреть детали с размерами примерно до 0,0002 мм, т. е. до 2000 ? (ангстрем), но не меньше: оптический прибор просто не может четко воспроизвести более мелкие детали. Световые волны просто не замечают эту мелочь, огибают ее, подобно тому как морская вода без труда перекатывается через мелкие прибрежные камни. Поэтому дальнейшее продвижение в область невидимого, за рубеж 2000 ? стало возможным только потому, что исследователи заменили свет более коротковолновыми потоками (для мелкой ряби на воде и маленький камушек — препятствие) и разработали удивительно остроумные методы прощупывания невидимых объектов невидимым лучом с последующим колоссальным — в десятки и сотни тысяч раз — увеличением «картинки».
Один из таких методов — рентгеноструктурный анализ, созданный трудами многих выдающихся физиков и позволяющий в мельчайших подробностях увидеть детали кристаллов. Сущность метода: на кристалл направляют рентгеновские лучи; детали кристалла — молекулы, атомы — рассеивают их; в пространстве вокруг кристалла образуется сложная волновая картина; там, где рассеянные волны суммируются, появляются так называемые рефлексы — пучки с высокой рентгеновской яркостью; координаты «рефлексов» и их яркость в итоге зависят только от расположения деталей кристалла; измерив яркость и координаты «рефлексов», можно вычислить структуру кристалла, построить его точную модель.
В принципе происходит примерно то же, что и при образовании изображения в микроскопе. И здесь, и там есть источник излучения — в одном случае свет, в другом — рентгеновские лучи. И здесь, и там изображение строится из лучей, которые рассеивает наблюдаемый объект. Но в микроскопе «картинку» строят линзы, а для рентгеновских лучей линз не существует, и их роль берет на себя вычислительная машина. Благодаря очень короткой длине волны рентгеновского излучения — около 1 ? — этот метод позволяет увидеть даже отдельные атомы. Более того, с помощью рентгеноструктурного анализа можно получить не плоскую, а трехмерную картину, воспроизвести пространственную структуру кристалла.
Настоящим триумфом рентгеноструктурного анализа стала расшифровка структуры белков, из которых предварительно выращивали кристаллы (для того, чтобы можно было применить рентгеноструктурный метод). Кристаллы эти чрезвычайно сложны, ибо сложны сами белковые молекулы, они состоят из тысяч и десятков тысяч различных атомов. Первые работы по расшифровке структуры белка миоглобина выполнили около 30 лет назад английские биофизики М. Перутц и Дж. Кендрью. Эти работы были отмечены Нобелевской премией, они открыли новую страницу в молекулярной биологии. Уже через несколько лет в лабораториях мира рентгеноструктурными методами был изучен и ряд других белковых молекул.
В Институте кристаллографии им. А. В. Шубникова АН СССР впервые был проведен рентгеноструктурный анализ и построена пространственная модель леггемоглобина — белка с неизвестной ранее структурой. Работу выполнила группа, которую возглавил академик Б. К. Вайнштейн. Мы попросили исследователей рассказать о выполненной работе, ее значении, о планах на будущее. В публикуемой ниже краткой записи беседы отдельные ответы, высказывания, пояснения ее участников суммированы (разумеется, с их согласия), и рассказ ведется от имени коллективного автора, от имени всей группы исследователей.
Корреспондент. Вначале, если можно, хотя бы несколько слов о самом леггемоглобине… Где он встречается? Что делает? Что о нем было известно раньше?
Исследователи. Белок этот относится к тому же классу, что и хорошо всем известные гемоглобин и миоглобин. Но в отличие от всех других подобных белков он имеет не животное, а растительное происхождение, синтезируется и работает в растениях, а не в организме животного.
Молекула леггемоглобина сравнительно невелика — ее относительная молекулярная масса около 16 000, т. е. примерно в 8 тыс. раз больше относительной молекулярной массы водорода или в тысячу раз больше молекулярной массы кислорода. Молекулярная масса леггемоглобина в несколько раз больше, чем у некоторых «маленьких» ферментов, но во много раз меньше, чем у крупных белков.
Леггемоглобин пока обнаружен только в корневой системе бобовых растений, и появляется он там лишь после того, как в корнях поселяются бактерии, участвующие в связывании азота воздуха. Роль аналогичных белков в жизни животного изучена детально — они участвуют в транспортировке и хранении кислорода, в сложных химических превращениях, снабжающих организм энергией. Например, гемоглобин, сосредоточенный в красных кровяных шариках нашей крови, «загружается» кислородом в легких, разносит его по всему организму, двигаясь вместе с кровотоком. Миоглобин запасает кислород в мышцах. В каждом из этих белков есть так называемая гемогруппа (сокращенно гем) — сложное многоатомное соединение с атомом железа в центре. Гем осуществляет обратимое связывание кислорода: легко присоединяет его и в нужный момент легко отдает. Имеется гем и в леггемоглобине.
Корреспондент. В какой последовательности ведется расшифровка пространственной структуры белка? Каковы основные этапы этой работы?
Исследователи. Таких этапов два: получение высококачественных кристаллов белка и сам рентгеноструктурный анализ. Оба этапа достаточно трудоемки, занимают многие месяцы, оба они, особенно получение кристалла, включают множество очень ответственных вспомогательных работ, длинные цепочки тонких и точных подготовительных операций. Это, кстати, характерно практически для всех современных биохимических и биофизических исследований…
Корреспондент. Назовите, пожалуйста, некоторые звенья одной такой длинной цепочки… Чтобы можно было хотя бы схематично представить себе, «как это делается»…
Исследователи. Возьмем, к примеру, получение кристалла. Работа началась в поле, началась со сбора клубеньков желтого люпина. Кстати, леггемоглобин существует в клубеньках всего несколько дней: когда растение отцветает, он очень быстро разрушается. Клубеньки сразу же, прямо в поле, замораживались сухим льдом и в дюаровых сосудах доставлялись в лабораторию. Затем начался цикл выделения самого леггемоглобина. Все операции этого цикла перечислить и то трудно. Вот лишь несколько: измельчение клубеньков, центрифугирование, предварительная очистка раствора, очистка раствора от низкомолекулярных соединений с помощью молекулярного сита, разделение белков на несколько фракций с помощью целлюлозных ионообменников, электрофорез одной из фракций с применением молекулярных сит для отделения леггемоглобина от похожих белков. Все эти работы включают вспомогательные химические реакции, контрольные операции. Все они проводятся при температуре 4 °C, чтобы уберечь белок от теплового разрушения. В итоге было получено 2 г чистого леггемоглобина, из растворов которого выращивались кристаллики длиной до 0,5 и даже до 1 мм.
Чтобы вырастить хороший кристалл, нужны месяцы, и здесь тоже есть масса тонкостей и сложностей. Но все это, конечно, так же как и химическая очистка белка, лишь подготовка к главному— к самому рентгеноструктурному анализу…
Корреспондент. Почти как на космодроме — уйма второстепенной, казалось бы, работы, а мелочей нет… Ну а после того, как кристаллический белок получен и на него, наконец, направлены рентгеновские лучи, после этого дело идет спокойнее, проще?
Исследователи. К сожалению, нет. На этом этапе тоже выполняется много ответственных операций. Во-первых, это получение самой рентгенограммы кристалла.
Рентгенограмма кристалла в виде фотографии с большим числом симметричных ярких точек — это лишь вспомогательный документ, иногда контрольный, а иногда просто иллюстративный. Само же рентгенографическое исследование кристалла осуществляется без «посредников», без видимой картинки. Делается это так. Счетчик Гейгера с очень малым входным отверстием тщательна исследует пространство вблизи кристалла, определяет интенсивность рассеянных кристаллом рентгеновских пучков.
С помощью прецизионного механизма счетчик перемещается и «прощупывает» каждый «рефлекс», измеряет его рентгеновскую яркость. Результаты измерений сразу же вводятся в вычислительную машину. Она же, кстати, управляет счетчиком, наводит его на «рефлексы», предсказывает их координаты. Измерения проводятся при разных положениях кристалла, когда рентгеновские лучи падают на него под разными углами. Выполненная нами работа — это первая очередь определения структуры леггемоглобина, которая предусматривала анализ около тысячи «рефлексов» от самого исходного кристалла.
После исследования «чистого» кристалла в некоторые его участки обязательно включаются атомы тяжелых элементов (уран, ртуть), и все начинается сначала. В итоге была измерена интенсивность около 20 000 «рефлексов». Рентгенограмма кристалла С тяжелыми атомами дает дополнительную информацию, совершенно необходимую для последующего вычисления структуры белка. Включение тяжелых атомов — довольно тонкая операция. Кристалл погружают в определенные растворы солей и выдерживают в них довольно долго.
И еще одна особенность: под действием рентгеновских лучей кристалл портится, разрушается. Поэтому, начав работать с каким-нибудь кристаллом и желая выжать из него как можно больше информации, приходится в течение многих суток вести измерения непрерывно, в три смены, как, например, на производстве с непрерывным технологическим процессом.
Корреспондент. Вы назвали выполненную работу первой очередью исследований. Что должна представлять собой вторая очередь? Третья?
Исследователи. Первая очередь работы позволила определить структуру леггемоглобина с разрешением 5 ?. При этом воспроизведена общая архитектура молекулы, конфигурация ее белковой цепи, расположение гема и других основных блоков. Детали с размерами менее 5 ? мы пока не видим. Вторая очередь работы должна улучшить разрешение до 2,8 ?, третья очередь — до 2 ? и менее. В этом последнем случае можно будет воссоздать структуру молекулы вплоть до отдельных атомов. В ведущих лабораториях мира несколько белков уже изучено со столь высоким разрешением, и, думается, нам удастся решить эту задачу для леггемоглобина.
Корреспондент. А что для этого нужно? Чем именно определяется точность детализации модели?
Исследователи. Точность модели определяется объемом измерений дифракционного поля кристалла, т. е. количеством промеренных «рефлексов». Так, например, чтобы получить разрешение 2 ?, нужно измерить интенсивность не менее 100 000 «рефлексов».
Корреспондент. Леггемоглобин — ваш первый белок. Какие мысли и чувства вызывает именно это обстоятельство, именно факт «первости»?
Исследователи. Самые разные. Мы хорошо понимаем, что рентгеноструктурный анализ белков — уже давно признанная методика. И все же полученный результат доставил нам большую радость. Здесь можно продолжить аналогию с космодромом. Бесспорно, самые первые космические свершения занимают совершенно особое место. Именно потому, что они первые, потому, что это шаги в неизвестность. Но и каждый последующий шаг, каждый последующий запуск — второй, десятый, пятидесятый — это тоже непростое, нелегкое дело. И успешное его завершение не может не радовать. И еще: каждый такой запуск имеет свое собственное, самостоятельное значение. Так же, кстати, как имеет свое собственное научное значение и расшифровка структуры леггемоглобина.
Публикуя запись этой беседы, хочется сделать два примечания. Одно частное — через несколько месяцев после выполнения первого цикла работ исследователи полностью завершили работу по расшифровке структуры леггемоглобина «с точностью до атомов» — удалось изучить устройство молекулы с разрешением 2 ?.
Второе примечание относится к общим вопросам, связанным с изучением структуры белковых молекул, и в частности лег-гемоглобина. Эта работа затрагивает ряд фундаментальных биологических проблем. Например, проблемы эволюции живого. Эволюция, видимо, нелегко создавала такие сложные агрегаты, как молекула гемоглобина или миоглобина, долго налаживала их серийное производство в живом организме. Немало пришлось повозиться природе, чтобы свирепый химический хищник — кислород— под влиянием гема и самой белковой нити стал дрессированным, ручным. Чтоб он всякий раз не схватывался намертво с железом, как это делают атомы кислорода в свободном состоянии, а легко присоединялся бы к железу. И чтобы легко, по первому требованию уходил, когда, скажем, гемоглобин попадает в ткань, где несколько понизилось парциальное давление кислорода. Или когда миоглобин получает сигнал, что мышцам необходимо топливо, необходимы новые порции кислорода для выполнения той или иной работы.
Для чего нужны эти детали в гигантских биохимических машинах животного — понятно. Но что они делают в растениях? Как туда попали? И когда? Может быть, белковые молекулы, имеющие гем, были еще у общего предка растений и животных? И попали в бобовые растения «в порядке исключения», для выполнения какой-то особой, неизвестной пока функции? А может быть, растительный белок леггемоглобин появился самостоятельно на поздних стадиях эволюции растений? А похож он на гемоглобин в принципе по тем же причинам, по каким бывают похожими предназначенные для одной и той же цели машины, совершенно независимо разработанные в разных конструкторских бюро.
Примечательно, наверное, еще и то, что работа, в принципе биологическая, выполнена в институте, представляющем точные науки, — в Институте кристаллографии. Это явление типично для нашего времени. Можно смело сказать, что в последние десятилетия очень большое число открытий в области биологии, а может быть, даже большинство этих открытий, сделано благодаря успехам точных наук, прежде всего физики, химии, математики. От физиков, например, биологи получили такой совершенный и универсальный метод, как исследование тонких биологических превращений с помощью радиоактивных меток: в какое-либо вещество подмешивают небольшое количество его радиоактивного изотопа и, регистрируя физическими приборами излучение этого изотопа, следят за перемещением данного вещества, за его включением в те или иные клеточные структуры. Или, скажем, такие методы, как электронный парамагнитный резонанс и ядерный магнитный резонанс — ЭПР и ЯМР. С помощью установок ЯМР и ЭПР воздействуют на исследуемое вещество и при этом очень точно дозируют энергию воздействия, определяя условие резонанса— совпадение внешней энергии с энергией связи электронов в молекулах и атомах. Это позволяет с очень высокой точностью определять структуру молекул, в частности, молекул биологических. В общем же можно сказать, что исследование структуры белковых молекул методами рентгеноструктурного анализа, в частности исследование структуры леггемоглобина, — это лишь один из многих вкладов физики в успехи биологических наук.
Расшифровка структуры леггемоглобина могла бы, наверное, представить интерес для специалистов, изучающих связывание атмосферного азота в почве. Азот — ключевая проблема для земледелия, для животноводства. Достаточно вспомнить, что внесение в почву азотных удобрений может во много раз поднять урожайность зерновых культур: поле, которое давало 5—10 ц хлеба с гектара, после внесения удобрений может дать 40–50 ц!
Азот в почве — это хлеб, корма, это изобилие пищи и растительного сырья. Элемент, жизненно необходимый для развития всего живого, азот не может прямо из атмосферы попасть в растение, в живой организм. Азот попадает в них сложным путем и только через почву, где связыванием атмосферного азота заняты некоторые виды бактерий. Тем из них, что поселяются в корнях бобовых, для работы по добыванию азота необходим леггемоглобин. Но — сами бактерии его не производят, они получают этот белок из растения. А оно в свою очередь начинает вырабатывать леггемоглобин лишь после того, как в корнях появляются бактерии.
Тонкая, точно отлаженная биологическая машина, один из множества шедевров, созданных живой природой… Понять устройство такой машины, с тем чтобы, может быть, улучшить ее, это прежде всего значит в деталях выявить длинные цепочки взаимосвязанных химических превращений, выяснить устройство и функции отдельных их участков, отдельных молекул и даже молекулярных фрагментов.
Одна из ступеней высокой крутой лестницы, ведущей к такому пониманию, — расшифровка структуры леггемоглобина. После успешного завершения этой работы в различных институтах страны, в том числе и в самом Институте кристаллографии, рентгеноструктурными методами расшифрована структура многих других сложных биологических молекул.